Sterilizácia Živných Pôd v mikrobiológií (Úvod do mikrobiológie)

Sterilizácia ŽP:

Z fyzikálnych prostriedkov sa na sterilizáciu najčastejšie používa suché a vlhké teplo i ultrafialové žiarenie.

Sterilizácia je plné odstránenie vegetatívnych foriem MO z prostredia. Sterilizáciu poznáme:

1. neúplnú – usmrcujeme iba určitú časť MO, môže ňou byť:

• pasterizácia – je to zahriatie živnej pôdy na teplotu 60 - 80°C pri asi 30 minútach, čí vyššia teplota, tým nižší čas pôsobenia, prežijú odolné formy a volá sa aj relatívna
• tyndalizácia – je to postupné zahrievanie živnej pôdy alebo kultivačného zariadenia na teplotu 100°C, počas viacerých po sebe idúcich dní. Usmrtia sa aj práve vyklíčené spóry, pretože pri ochladení začnú klíčiť a opätovné zahriatie ich usmrtí

2. úplnú – mechanická, chemická, fyzikálna

Ø      fyzikálna - laboratórne pomôcky a sklo sterilizujeme suchým teplom buď    plameňom (vypálenie,opálenie), alebo horúcim vzduchom.

• Suché teplo:

a/ Vypálenie používame pri sterilizácii bakteriologického očka a   očkovacej ihly tak, že v

nesvietivej časti plameňa rozžeravíme chrómniklový drôtik po celej dĺžke.

b/ Opálenie používame pri sterilizácii zátok a hrdiel nádob so živnými    pôdami alebo

kultúrami mikroorganizmov vždy,  keď nádobu otvárame     alebo  zatvárame.  Opálením

plameňom zničíme mikroorganizmy na povrchu  nádob a zamedzíme vnikaniu nesterilného

vzduchu z okolitého prostredia do nádob.

c/ Horúcim vzduchom sterilizujeme v horúcovzdušných sterilizátoroch   laboratórne sklo a

predmety znášajúce vysoké teploty. Pretože musíme   dosiahnuť stupeň absolútnej sterility,

sterilizujeme teplotou 160°C po dobu 2 hodín.

• Vlhké teplo - používame pri sterilizácii kovových predmetov, nástrojov i živných pôd vo forme vriacej vody a vodnej pary, a to buď za atmosférického tlaku alebo za zvýšeného tlaku.

a/ Prúdiaca para pri atmosférickom tlaku sa používa pri sterilizácii živných pôd- alebo predmetov, ktoré by sa teplotou vyššou ako 100 °C znehodnotili. Para tu dosahuje teplotu 99 °C, čo je teplota postačujúca usmrteniu vegetatívnych buniek mikroorganizmov, ale nie na zničenie spór. Spóry, ktoré takto prežijú, usmrtíme opakovanou (frakcionovanou) sterilizáciou, pri ktorej pôsobíme uvedenou teplotou po dobu 15 až 20 minút a opakujeme ju 3 razy s prestávkami 24 hodín. Spóry, ktoré neboli pri prvej sterilizácii usmrtené, počas prestávky vyklíčia a ako vegetatívne formy ich zničíme druhým, prípadne tretím opakovaním sterilizácie.

Kochov prístroj – teplota do 100°C, 20 minút, 3x po 24 hodinách

Autokláv - 120°C, zvyšuje sa tlak v nádobe na 1 MPa, 20 minút, stačí 1x

b/ Nasýtená vodná para za zvýšeného tlaku v autoklávoch sterilizuje také živné pôdy, ktoré znášajú vplyv vyšších teplôt bez kvalitatívnych zmien. Keďže nasýtená vodná para má vyššiu teplotu ako 100 °C, môžeme dobu sterilizácie primerane skracovať. Obyčajne sterilizujeme pri tlaku 0,10 MPa, čo zodpovedá teplote 120 °C po dobu 20 minút.

• Ultrafialové žiarenie:

ü       používame pri sterilizácii vzduchu v laboratóriách a v očkovacích boxoch. Zdrojom žiarenia je UV žiarič (germicídna žiarivka). Tieto lúče s krátkou vlnovou dĺžkou sa najviac absorbujú na nukleové kyseliny v bunkách mikroorganizmov, preto je ich sterilizačný účinok vysoký. Doba pôsobenia je minimálne 20 minút a je závislá od veľkosti miestnosti a výkonu žiariča.

Ø      Sterilizácia chemickými prostriedkami

·        Niektoré laboratórne pomôcky z plastických hmôt sú termolabilné a nemožno ich sterilizovať vysokými teplotami.

·        Pre takéto predmety je výhodná chemická sterilizácia. Zo zlúčenín, ktoré sa bežne používajú ako dezinfekčné prostriedky, môžeme použiť len také, ktoré sú zároveň prchavé aj toxické.

·        Chemické prostriedky sa používajú v mikroskopickom laboratóriu tiež na dezinfekciu pracovných plôch (stoly, podlahy, steny laboratórií) a pracovných nástrojov potrebných pri odbere vzoriek (rýľ, lopatka).

·        Najčastejšie sú to aldehydy (formaldehyd), halogény (chlórové vápno, jódoform) a ajatín.

Ø      Sterilizácia mechanickými prostriedkami

·        Tento typ sterilizácie používame najmä pri zabezpečení sterilných podmienok v určitých pracovných priestoroch. Je založený na mechanickom zachytávaní mikroorganizmov filtráciou, sedimentáciou a odstreďovaním.

a) Filtráciou  - odstraňujeme mikroorganizmy z plynných a tekutých prostredí pomocou filtrov s veľmi malými pórmi, ktoré zachytávajú mikroorganizmy počas prechodu cez filter. Filtrácia je účinná pre baktérie, podstatne sa znižuje v prípade vírusov, lebo ich rozmery sú menšie ako rozmery pórov na filtroch. Existuje niekoľko typov filtrov, ktoré sa líšia konštrukciou i použitým materiálom: keramické, azbestové, sklené a membránové filtre.

b) Sedimentáciou  - sterilizujeme vzduch, z ktorého elektrostaticky zrážame prachové častice a s nimi aj mikroorganizmy (elektrostatické filtre).

c) Odstreďovaním -  odstraňujeme mikroorganizmy z tekutín, pričom používame vysokoobrátkovú centrifúgu. Centripetálna časť skúmavky je Číra a relatívne sterilná, centrifugálna časť obsahuje odstredené mikroorganizmy.